测序原理:第一代、第二代、第三代测序原理详解。

双脱氧链终止法采用了DNA复制的原理。Sanger测序反应系统包括靶DNA片段、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)、测序引物和DNA聚合酶。测序反应的核心是所用的ddNTP:由于缺少3’-OH基团，不具备与另一个dNTP形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用于终止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP与放射性同位素或荧光标记基团相连，因此它们可以被自动化仪器或凝胶成像系统检测到。

罗氏的454技术、illumina的Solexa/Hiseq技术和ABI的SOLID技术标志着第二代测序技术的诞生。罗氏的454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化的测序平台。

其中Illumina的市场规模占75%以上，主要有Miseq和Hiseq。下面？本文主要介绍其PE(Pair End)测序原理:

名词:

流动池:测序反应的载体/容器。在1个流动池中有8个泳道。

泳道:测序反应的平行泳道，试剂添加和洗脱过程在此进行。

平铺:每次荧光扫描的位置肉眼看不到。

双端测序:序列可能有四五百bp长，两边都是120-150bp。

连接处:双端测序中间的一些未检测到的区域。

索引(条形码):一个泳道通常需要测量多个样本，每个样本都标有特定的序列，以区分不同的样本。

流通池结构:一个通道包含两个条带，每列有60个瓦片，每个瓦片将种植不同簇，每个瓦片将在一个循环中拍摄四次照片(每个基底一次)。

中断后末端会不平整，会被酶填满，所以现在的序列是平端的。

整平完成后，用酶在3’端加上一个特定的碱基A，加上A后，就可以利用互补配对的原理了。加上衔接子后，衔接子可分为两部分，一部分是测序所需的引物序列，另一部分是文库构建和扩增所需的引物序列。

进行PCR扩增，使我们的DNA样本浓度足以满足计算机要求。

Reads1和reads2不重叠。

流动池是吸附流动DNA片段的通道，测序在这里进行。上面构建的文库中的待测序列预先配置了一定的浓度，当它经过这里时，会在特定化学试剂的作用下，强烈地随机附着在lane上，与上面的短序列配对。作为装载的结果，lane吸附了冲走的DNA，并且它可以通过表面上的桥PCR扩增。

双端测序的正向链:

为什么Illumina测序有长度限制？

Hiseq2000序列器

测序仪配有两个流动池，称为双流池。经典的Hiseq2500一次可以产生700-800Gb的数据(其中Gb是测序碱基数，与字节数不同)。

数据量=单端读取长度*单端读取次数* 2(PE)

测序深度=数据大小/参考基因组大小

这是一个新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和牛津纳米孔技术公司的纳米孔单分子测序技术为标志，被称为第三代测序技术。与前两代相比，最大的特点是单分子测序，不需要PCR扩增，阅读长度极长，平均达到10Kb-15Kb，是第二代测序技术的100倍以上。值得注意的是，在测序过程中，这些序列的阅读长度不再相等。

1./p/101c 14c 3a 1 D2

2./p/20702684

3./s/tw hwa-f 1 RNP _ xwy 66 p 12pg

4./s/9KUY43lD5miLdPZJKgRV0A