nm23-H1基因转染L9981肺癌细胞前后基因表达谱的变化
关键词:l 9981；基因芯片；基因表达；Nm23-H1基因
中国图书馆分类号:R734.2；Q813.1
文件识别码:a
货号:1007-7847(2006)01-0077-05。
nm23-H1基因已被证明是肿瘤转移抑制基因。将nm23-H1基因的cDNA转化到缺失nm23-H1基因表达的人高转移大细胞肺癌细胞系L9981中，可以逆转其恶性表型。然而，nm23-H1抑制肺癌侵袭和转移的分子机制尚不十分清楚。我们前期的研究表明，nm23-H1基因对肿瘤侵袭和转移的抑制作用可以通过调控转移相关基因来实现。为了进一步研究nm23-H1的分子机制，我们用基因芯片检测了nm23-Hl对L99865438的转染情况。
1材料和方法
1.1材料
l，1.1细胞系
1)L9981(高转移大细胞肺癌细胞系)；2) L9981-nm23-H1(稳定表达nm23-H1基因的L9981细胞系)。全部由四川华西医院肺癌分子重点实验室提供。
1.1.2常用试剂和设备
精制小牛血清和RPMI t640培养基购自Hy- clone公司。用1.20 mmol/L的NaOH溶液配制成1 mmol/L的储备液，储存于4℃。上标TM II核糖核酸酶H-逆转录酶(1氮催化。编号18064-014)、dATP、dGTP、dCTP、dTYPOligod(T)引物(Bioasia Synthesis)、Cy5 (Amersham，Cat，编号PA55021)、Cy3(阿默舍姆，猫。编号PA53021)、RNA抑制素(Takara，Cat。编号D2311A)、Ola快速核苷酸可拆卸试剂盒(OIAGEN，Cat，编号28306)基因机:OmniGrid 100Pixsys5500芯片打印仅从Carte― sian公司购买，ScanArrayLite芯片扫描仪及其分析软件Quantarray从GsiLumonics公司购买，载玻片和芯片的混合盒从Coming公司购买。
1.1.3基因芯片
项目使用的芯片版本号为2.2人类cDNA基因表达谱芯片，产品目录号为SBC-R-HC-100-22，芯片编号为17874、17873(上海生物芯片工程公司)。
1.2方法
从1.2.1中纯化总RNA
(RNeasy Mini Kit)总RNA用QIAGEN RNeasy Kit纯化。详细操作原理和方法参见rn easy Mini protocol 01。
1，2，2总RNA的质量检测
(Labonchip检测)具体操作步骤参见人类cD- NA表达谱芯片用户手册，SBC-H-HC-100-22，详细结果参见样本质量检测报告。芯片实验室参照Agi- lent 2100分析仪操作手册，制备凝胶，根据软件提示进行RNA电泳操作，评估RNA质量。
1.2.3样品制备
用Sau3Al消化CDNA，然后用接头连接，然后用PCR通用引物扩增。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化，取出500 ng。实验标记方法为cDNA直接标记法，实验组RNA (L9981-nm23-H1)用cy3荧光标记，对照组RNA (L9981)用cy5荧光标记。加入Cy3/ Cy5标记的引物(100 LLM 01/L)21LL(用NaOH处理的对照组用Cy5标记，用As20处理的处理组用Cy3标记)，然后在相同条件下进行PCR扩增和纯化，将PCR产物的终浓度调整为200 mg/L。
1，2.4杂交
95℃变性后，将标记样品加到预杂交芯片阵列表面，盖上盖玻片，置于杂交盒中，42℃杂交18h。
1.2.5检测和分析
芯片结果用安捷伦扫描仪扫描，扫描分辨率10μm，PMT 100%%数据用Ima- gene软件读取。最后用Genespring进行归一化分析，最终比值为cy3/cy5，即实验组/对照组。差异基因的筛选标准为(1)比值>:Or =2为上调基因，比值= 0.5为下调基因。
1.3的统计分析
聚类分析方法。利用genespring和聚类分析软件进行聚类分析。
2个结果
2.1细胞总RNA电泳图谱
两个细胞系(L9981、nm23-H1和L9981)的总RNA提取纯化后，1%琼脂糖凝胶电泳可见明显的28、18和5S条带，28S条带明显比18 S条带亮
2.2基因芯片杂交结果及分析
然后将Cy5和Cy3的扫描图像完全重叠，在得到的杂交图谱中(图2)，红点表示低表达，绿点表示高表达，黄点表示表达水平没有变化。经过软件分析，得到芯片杂交的散点图(图3)。每个点的y轴代表Cy3杂交信号的相对强度，x轴代表Cy5杂交信号的相对强度。45度直线上的点(实线所示)的Cy5/Cy3比值为L，表示没有差别，远离45度直线的点表示差别较大，落在两条虚线外的点为Cy3/Cy5比值大于2或小于0.5的点。
2.3基因芯片筛查结果
nm23-H1基因转染L9981细胞前后，共有***l792个基因，其中表达增加(上调)至1156，表达减少(下调)至642。在上调的基因中，有1038个基因功能未知。其中细胞周期和凋亡相关基因31，癌基因0，肿瘤抑制基因18，转移相关基因12，细胞因子和转录因子13，细胞信号和蛋白相关基因38，细胞外基质和细胞骨架蛋白9，其中功能有541。但已知基因有101个，其中与细胞周期和凋亡相关的基因有12个，与癌基因相关的基因有11个，与抑癌基因相关的基因有3个，与转移相关的基因有14个，与细胞信号和蛋清相关的基因有21个。
3讨论
nm23-H1基因是一种肿瘤转移抑制基因，其低表达和缺失与肺癌的侵袭和转移密切相关。我们前期的研究发现，nm23-Hi基因蛋白和mBNA的低表达、突变和等位基因缺失与肺癌的高转移和不良预后密切相关。在具有高转移潜能的人高转移大细胞肺癌L9981细胞中存在nm23-HI等位基因杂合性缺失。L9981细胞具有较强的体外克隆和侵袭能力，裸鼠自发性肺转移能力为100%。已有研究表明，将nm23-HI基因导入L9981细胞系可以逆转其恶性表型，表现为在裸鼠体内的增殖能力、克隆形成能力、侵袭能力和自发性肺转移能力显著降低。清华周等发现nm23-H1基因缺失的肺癌常伴有某些肿瘤侵袭相关分子的异常表达，推测nm23-H1基因可能是“肺癌转移抑制级联”相关基因的上游调控基因，其对肿瘤转移潜能的抑制作用是通过调控下游基因实现的。然而，nm23-HI基因逆转肺癌恶性表型的分子机制尚不清楚。
基因芯片技术为我们研究nm23-H1结构和功能改变导致肺癌侵袭转移的分子机制提供了理想的技术支持。基因表达谱芯片具有高通量、大规模、高效率、高灵敏度的特点，可以分析两组或两组以上不同来源的mRNA丰度的差异。通过计算杂交信号的比率和统计分析，我们可以获得差异表达的基因信息。
本实验利用肿瘤基因表达微阵列分析nm23-H1基因转染L9981细胞前后相关基因的表达变化。基因表达微阵列的应用为研究nm23-H1基因的分子机制提供了基因组学证据，突破了以往单一基因分离研究的局限。特别是将外源基因导入不表达该基因的细胞，避免了样品取样的组织学差异，使得实验结果更加可靠，也更容易分析。本研究采用含有14 000个基因的SBC-R-HC-100-22cDNA基因表达谱芯片，在L981细胞中转染nm23-Hl基因。通过比较它们基因表达的差异信息，寻找与nm23-H1基因表达相关的基因。本研究中，* *筛选出1792个差异表达基因。nm23-Hl基因转染后，共有1156个基因，其中1035个基因。基因表达下调的基因有642个，其中541为未知基因，101为功能原因。已知上调和下调的基因包括:细胞周期和凋亡基因、癌基因、肿瘤抑制基因、转移相关基因、胞质分裂和转录因子、细胞信号和蛋白相关基因、细胞外基质和细胞骨架蛋白。在上调的基因中，有许多与肿瘤转移相关的基因，如E-Cad、β-catenin、nm23和TIMP-1，2等。，而与肿瘤转移相关的下调基因主要有Ras、VEGF、PDGF-A、ERK-/、2、c-src等。这些结果与我们之前的研究结果一致。
但本研究也发现，nm23-H1基因的高表达还可以增加某些肿瘤抑制基因的表达，增强细胞因子和转录因子的活性，提高细胞外基质酶的活性，影响细胞骨架蛋白的合成。因此，可以推断nm23-H1基因可以通过抑制细胞的增殖能力和克隆形成率、降低基质金属蛋白酶的活性、抑制促血管生成基因的表达等多种途径抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，进而抑制肿瘤的侵袭和转移。可见nm23-Hl基因对L9981细胞恶性表型的逆转是通过下游相关基因的调控实现的，是“肺癌转移抑制级联”正向调控中的关键基因和上游基因。
总之，肿瘤的侵袭和转移是多种基因和因素相互作用的结果，一个或两个关键基因在时间和空间上相互配合，促进了细胞的癌变、侵袭和转移。因此，在研究肿瘤侵袭转移的分子机制时，也要分析多个基因，而不仅仅是几个单一基因。基因芯片为研究肿瘤的发生发展以及基因之间的相互作用提供了有力的研究工具。本文为原文全文。没有PDF浏览器的用户应该先下载并安装原文全文。