如何设计EMSA实验探测器？
1)什么是凝胶迁移或电泳淌度实验？
凝胶迁移或电泳迁移实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白与其相关DNA结合序列之间相互作用的技术，可用于定性和定量分析。该技术最初用于研究DNA结合蛋白，现在已用于研究RNA结合蛋白与特定RNA序列的相互作用。
通常，将纯化的蛋白质、细胞粗提物和32P同位素标记的DNA或RNA探针一起孵育，在非变性聚丙烯凝胶电泳上分离复合物和未结合的探针。DNA复合物或RNA复合物比未结合的探针移动得更慢。根据所研究的结合蛋白，同位素标记的探针可以是双链的或单链的。当检测DNA结合蛋白如转录调节因子时，可以使用纯化的蛋白、部分纯化的蛋白或细胞核提取物。当检测RNA结合蛋白时，根据靶RNA结合蛋白的位置，可以使用纯化或部分纯化的蛋白或细胞核或细胞质细胞提取物。在竞争实验中，DNA或RNA片段和含有蛋白结合序列的寡核苷酸片段(特异性)和其他不相关的片段(非特异性)用于确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在存在竞争性特异性和非特异性片段的情况下，特异性结合根据复合物的特征和强度来确定。
2)这样的实验需要什么试剂？
凝胶迁移实验所需的结合蛋白可来源于纯化或部分纯化的蛋白或粗细胞核和细胞质提取物。还必须制备同位素标记的DNA或RNA。通常，DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶标记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。Promega的核糖探针？/sup系统(a，b)(目录号P1420、P1430、P1440、P1450、P1460)可用于体外合成同位素标记的RNA，以及DNA 5′-末端标记系统(目录号u20)结合反应所需的成分有:盐水溶液(氯化镁、氯化钠或氯化钾)、缓冲系统(Tris-HCl或HEPESDI:dC)，也可以含有非离子洗涤剂。结合蛋白与同位素标记探针作用后，在非变性聚丙烯凝胶电泳上分离出复合物，然后凝胶干燥放射自显影，或者凝胶与磷光图像一起使用？/sup分析。
3)凝胶迁移实验系统提供了哪些试剂？
Promega公司提供了检测DNA结合蛋白的凝胶迁移实验系统，可作为此类实验的阳性对照。该系统包括靶寡核苷酸、对照DNA结合蛋白、结合缓冲液和寡核苷酸探针末端标记所需的试剂。核心系统(目录号E3050)包括含有重组AP2蛋白的大肠杆菌提取物(AP2提取物)和AP2的同源寡核苷酸。AP2提取物是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的。此外，核心系统还包含SP1同源寡核苷酸、凝胶迁移结合缓冲液(5’)，以及可用于20个对照实验的HeLa核提取物。完整系统(目录号E3300)包含五个其他双链寡核苷酸，它们是AP1、OCT1、CREB、NF-kB和TFIID的结合位点的同源序列。这些寡核苷酸可以在末端标记后用作特异性探针，或者在竞争性实验中用作非特异性探针。更多信息请参考凝胶迁移实验技术手册TB110。
4)凝胶运移实验成功需要优化哪些因素？
凝胶迁移实验理论上简单快速，但要成功进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这些参数主要受结合蛋白来源和探针结合位点特性的影响。以下因素需要优化:提取液的制备(核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解)、结合蛋白浓度、探针浓度、非特异性探针浓度、缓冲液的配方和pH、聚丙烯凝胶电泳的特性和电泳条件、孵育时间和温度、载体蛋白、是否有辅助因素(如锌、镉等金属离子，或激素)。简而言之，总反应体积应该是最小的(20ul)。为了满足一般要求，结合缓冲液含有4%甘油、1mmgcl2、0.5mm EDTA、0.5mm DTT、50mm NaCl、10mm tris-HCl (pH 7.5)和0.05mg/ml聚(di: DC)？dI:dC，或者10mm Hepes (pH 7.9)，50mmkcl，1mm DTT，1mm EDTA，10%甘油，0.05mg/ml聚(DI:dC)？DI:dC可以作为优化实验的开始。更多信息请参考凝胶迁移实验技术手册TB110。
5)提供了哪些同源多核苷酸引物，这些引物的序列来源是什么？
dsDNA探针种类繁多，包含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列出了可用的探针和这些引物序列的来源。
转录调节因子探针
-
探针名称目录编号序列(缠绕)序列的来源
Sp1e3231，e 32325′-att CGA TCGGGGGGGGGGGCG-3′SV40启动子(1)
AP 1e 3201e 32025′-cgcttgatgatcagccggaa-3′胶原酶基因TRE(2)
ap2e 3211e 32125 '-gatcga act广汽CGCC CCG CCG GT-3 '人金属硫蛋白II a(3)
基因NF-KB E3291，E3292，5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′小鼠Igk轻链基因(4)
oct 1e 3241e 32425′-TGT CGA ATG CAA ATC act aga A-3′ig重链基因(5)
CREB e 3281e 32825′-agagat TGC CTG ACG TCA GAC AGC Tag-3′大鼠生长激素抑制基因(6)
tfi id e 3221e 3222 5′-GCA gag cat ATA agg TGA gg taga-3′Belta-1球蛋白启动子。
仅列出了上链序列，探针是双链的，下链序列与上链序列配对。粗体表示序列来源于特定的基因序列，由转录调节因子结合的序列用下面的线表示。一般来说，周围的核苷酸是任意的。
DNA探针的选择需要考虑哪些重要因素？
目标DNA的长度应该小于300bp，以便于未结合的探针和蛋白质DNA复合物的电泳分离。双链合成寡核苷酸和限制性酶片段可用作凝胶迁移实验中的探针。如果已经鉴定了靶蛋白，则使用短的寡核苷酸片段(约25bp ),以便可以将结合位点与其他因子的结合位点区分开。长限制性片段可用于定位推定的启动子/增强子区域中的蛋白质结合位点。随后，DNaseI印迹可用于在DNA序列水平上分析蛋白质结合的特定区域。
7)能与下列转录调节因子和HeLa核提取物形成什么复合物:ap1，AP2，CREB，nfkb，oct 1，sp1，tfiid，tfiib。
当HeLa核提取物作为结合蛋白的来源时，每1个转录调控因子与其相关的DNA同源序列结合形成特征性的结合形式。下文描述了每一种转录调节因子，包括公认的同源序列、因子的大小、特异性结合条件以及可与HeLa核提取物形成的复合物的数量。
1.ap1: ap1(激活蛋白1)是一种转录调节子，其结合同源序列为5′-TGA gtca-3′。当AP1的结合位点存在于基因的启动子区域时，这些基因可以被诱导，例如蛋白激酶C (2，7)可以被佛波酯诱导。在细胞中，AP1形成c-Jun或Jun相关蛋白的同二聚体，或c-Jun或Jun相关蛋白和c-Fos或Fos相关抗原(Fras)的异二聚体。Fos蛋白本身不能形成同型二聚体，不能单独与AP1结合位点结合。C-Jun蛋白是一种40kDa的单体蛋白，通过亮氨酸拉链形成同型二聚体。在HeLa细胞中，AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同型二聚体。在凝胶迁移实验中，形成了特定的复合物。在确定AP1的活性作为凝胶迁移实验时，除了基础溶液成分外，0.01mg/ml聚(dI:dC)？Di: DC)，向结合缓冲液中加入100 ug BSA和5 mm DTT。如果使用纯化的蛋白质，则使用1-2ug蛋白质来检测迁移复合物。
2.AP2: AP2是一种转录调节因子，可分别用作TPA-和cAMP-诱导因子(10)。它是一种52 kDa的蛋白质，公认的同源序列是5′-CCCGGC-3′或5′-GCCCNNGGC-3′(3)。这种因子对视黄酸特别敏感，并可能在形态发生中起重要作用。HeLa核提取物与AP2同源DNA探针形成特异性复合物。当纯化的蛋白质用于凝胶迁移实验时，使用20-50ng的蛋白质。
3.CREB: CREB是一个37 kDa的转录调节子，识别响应cAMP的5′-t(g/t)ACG TCA-3′DNA(6，11)的同源序列。包含亮氨酸拉链结构以形成同型二聚体，相关的基本结构域与c-JunDNA结合结构域同源。当使用HeLa核提取物时，它可以与CREB同源序列形成复合物。
4.NF-KB: NF-KB最初被鉴定为与B细胞中免疫球蛋白K轻链的增强子结合。但后来在非B细胞的细胞质中发现，形成NF-kB和IkB的复合物。最初从DNA结合蛋白复合物中分离的NF-kB是由p65(RelA)和p50组成的异二聚体。其他分离的单体包括p49(也称为p52)、p75 (c-rel)和p68 (relb)。单体p65、p68和p75起反式激活作用。P50和p49(p52)单体具有DNA结合活性，但仅有少量反式激活。据报道，p49和NF-kB单体p65形成具有转录活性的异源双链体，类似于p50/ p65异源双链体。P49/ p65和p50/ p65异二聚体在细胞质中由一种叫做IkBa/MAD-3的抑制剂调节。IkB和p65单体的结合阻止了在细胞核中的定位和DNA的结合。在体外，高浓度的p65可以形成同型二聚体，其可以与DNA弱结合。聚(dI:dC)可以抑制这种反应(14)。P49和p50也能形成同源二聚体，但在细胞中的浓度很低。通常在NF-kB的凝胶迁移实验中，在20ul的反应体积中有0.28皮摩尔的NF-kB9寡核苷酸(pH 7.9)，50 mm MKCl，0.2 mm EDTA，2.5 mm DTT，65，438+00%甘油和0.05% NP-。当使用纯化蛋白时，250-300ng足以形成凝胶迁移复合物，而需要10ug的HeLa核提取物。凝胶迁移复合物在室温下孵育30分钟，凝胶迁移复合物在7%聚丙烯酰胺凝胶电泳中用50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸分离。含有考马斯蓝和二甲苯蓝色素的样品溶液只能加入到阴性对照反应中，因为这两种色素会加剧NF-kB复合物的解离。当HeLa核提取物用作结合蛋白源时，可以形成两种序列特异性凝胶迁移复合物，即p50/p50同二聚体和p50/ p65异二聚体。在表达p49、p50和p65的细胞中可以检测到四种序列特异性凝胶迁移复合物(p49/P49、p50/P50、P50/p65、p49/ p65)。如果有高浓度的P65，可以检测到少量的p65/p65。以下试剂可在体外增强NF-kB的结合:mM GTP、ATP、精胺、亚精胺、钡或钙离子、ng Co+3(NH3)6(12)。
5.OCT 1: OCT 1是OCT转录调节子家族的一员，显然广泛存在于哺乳动物细胞中(5)。POU域包括POU盒和同源域。当使用HeLa核提取物时，可以检测到与OCT1同源探针形成的序列同源凝胶迁移复合物。
6.Sp1: Sp1是一种O-糖基化转录调节因子，识别长度为10个核苷酸的同源序列5′-GGGGGGGGGC-3′(1)。核心识别序列为5′-GGGGGGGGG-3′。与核心序列相似的序列通常存在于启动子中。一个例子是SV40的早期启动子，它是第一个能与SP1结合的启动子。根据糖基化的不同，其分子量为95-105kDa，DNA结合域的三个锌指纹决定了序列的特异性。HeLa核提取物与SP1同源探针形成特异性凝胶迁移复合物。
7.tfiid/TFIIB: tfiid和TFIIB是基础转录调节子，参与RNA聚合酶II启动子(16)的基础转录。TFIID与真核启动子的TATA区形成特异性DNA结合。TFIID由几种蛋白组成，其中TATA结构域结合蛋白(TBP)参与TATA序列的结合。TFIID的其他蛋白质成分被称为TBP相关因子(TAFs)。用TFID探针寡核苷酸和HeLa核提取物可得到一条弱的凝胶迁移带，但很难鉴定为TFID序列特异性凝胶迁移复合物。纯化的重组TBP很难做凝胶迁移实验，部分原因是由于TBP带很强的正电荷，使得TBP/DNA复合物很难进入凝胶。纯化的TBP形成二聚体后不能与DNA(17)结合。因此，形成的二聚体可以参与DNA结合。TFIIB不单独与DNA结合，但在与TFIID结合后，它增强了与DNA的结合。
在TFIIB与前启动复合物结合后，RNA聚合酶II和TFIIF与转录起始区结合。因此，TFIIB在启动前复合体的形成中起着重要的作用。当纯化的TFIID用于凝胶迁移实验时，不需要向结合反应中加入聚(dI-dC)。结合缓冲液含有10%甘油、20 mm tris (pH 8.0)、10 mm MgCl2、2 mm DTT和89 mm KCl。聚(dG:dC)可以加入到TFIID的凝胶结合实验中。dG:dC .形成的复合物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凝胶成分为:0.5'TBE，6%聚丙烯酰胺凝胶(19:1丙烯酰胺:二分法)，4 mmg cl 2，0.02%NP-40，电泳缓冲液成分为:0.5'TBE，4mMMgCl2。当研究含有TFIID和TFIIB的复合物时，应从结合缓冲液、凝胶和电泳缓冲液中除去MgCl2。这些是一般要求。当使用不同的细胞提取物、TFIID和TFIIB形成复合物进行凝胶迁移实验时，要优化许多因素以达到理想的条件。
8)在凝胶迁移实验中使用多少蛋白质或提取物和标记的DNA探针？
对于每种特异性结合蛋白和探针，需要优化所用的纯化蛋白、部分纯化蛋白和粗核提取物。一般纯化蛋白的用量在20-2000ng之间，蛋白与DNA的等摩尔比可以调整到DNA的5倍。对于粗核提取物，需要1-20ug蛋白质来形成特异性复合物。反应加入的探针量为50，000-200，000 CPm32 P标记探针(高比活性)，反应体积为65，438+0-5 ul。这相当于10-50毫摩尔的DNA探针。探针应储存在-20℃以防止降解，并且必须在合成或标记后的1-2周内使用。探针和结合蛋白都应避免反复冻融。
9)体外翻译可以制备蛋白质吗？
Promega并没有对所有的转录调节因子进行这样的测试。通常，小麦胚芽提取物用于哺乳动物转录因子或DNA结合蛋白的体外翻译，兔网织红细胞裂解物可能含有内源性哺乳动物转录因子或DNA结合蛋白。但是TNT呢？/sup & gt；用兔网织红细胞裂解系统(a、b、c、d)与超越TM生物素标记的tRNA(目录号E3201)一起翻译转录调节子AP1(c-Jun)，制成AP1同源寡核苷酸(目录号E3201)。TNT？/sup & gt；T7偶联的小麦胚芽提取物(b，c，d，e)在体外翻译c-Rel。这种蛋白质特异性迁移免疫球蛋白K轻链增强子的探针。加入体外翻译成c-Rel结合反应的MAD-3(IKB家族成员)可以干扰其相互作用。
10)聚(dI:dC)？DI:dC)，非特异性竞争DNA和特异性竞争DNA的作用是什么？
它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特殊的结构，可以抑制蛋白质与标记探针的非特异性结合，避免假复合物。在凝胶迁移反应中加入聚(dI:dC)？DI:dC)能抑制粗核提取液中其他DNA结合蛋白的结合，如转录调节因子的非特异性结合。纯化蛋白用于凝胶迁移反应时，不需要加入聚(dI:dC)？DI:dC)，如果添加的话，普通反应使用的最终浓度不会超过50-100ng。对于核提取物，每2-3ug核提取物使用1 ug聚(dI:dC)？dI:dC).为了确定形成的复合物的特异性，在有或没有递增的非放射性特异性竞争性DNA或非特异性竞争性DNA的情况下进行结合反应的竞争性实验。一般来说，非放射性特异性DNA是未标记的DNA探针，非特异性竞争性DNA，与DNA探针具有相同的长度组成，但序列不同。能与非放射性特异性DNA竞争但不能与非特异性竞争性DNA竞争的复合物表明靶蛋白和同位素标记探针的特异性结合。非特异性结合可以被特异性DNA和非特异性竞争性DNA竞争。结合液中的聚(dI:dC)？DI:dC)需要优化，但一般用0.05mg/ml。非放射性(特异性或非特异性)竞争性DNA的剂量也需要优化或滴定，但竞争性DNA通常是同位素标记探针的10-1000倍(w/w)。其他类型的竞争性DNA，如小牛胸腺DNA，不能用于凝胶迁移反应，它们将携带目标蛋白的结合位点。
11)什么样的凝胶条件用于分离蛋白质/探针复合物和游离探针？
将结合蛋白或粗核提取物与靶探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可以通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6% (30: 1丙烯酰胺:二元)，在一定条件下可以使用高浓度或低浓度。PH、聚丙烯酰胺的浓度和丙烯酰胺与二嵌段丙烯酰胺的比例将影响凝胶中复合物的迁移。10-15伏的电压用于大多数蛋白质，短时间高电压(30-35伏)的电压用于快速解离的蛋白质。电泳中使用的TBE和TAE必须是新制备的，没有沉淀。丙烯酰胺基质的低离子强度和“盒效应”有助于复合物的稳定性。TGE缓冲液(12.5mMTris，pH8.3，95mM甘氨酸，0.5mMEDTA)也可用于不稳定的蛋白质/DNA复合物。结合和电泳实验可在40℃下进行，以防止不稳定复合物和探针的解离。样品溶液中的色素会导致不稳定络合物的离解，因此应使用不含考马斯蓝和二甲苯蓝的样品溶液。当带型不紧密，出现拖尾时，说明化合物解离。凝胶必须完全聚合以避免条带拖尾。如果复合物没有进入凝胶，则表明使用的蛋白质或探针过量，或者盐的浓度对于该反应来说太高。含提取物的试纸条中没有游离探针或复合物，而只含探针的试纸条中有探针，说明提取物被核酸或磷酸酶污染，所以在提取物中和结合反应中要加入相应的抑制剂。目前可以用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白质/探针复合物(比喻？/sup/琼脂糖).
12)如何确定特定化合物中存在一种蛋白质？
部分纯化的蛋白质或粗核提取物和特异性探针可以形成一种或几种特异性蛋白质复合物。多重复合物的存在表明蛋白质降解，在制备提取物的溶液中和结合反应中应加入蛋白酶抑制剂。可能很难确定复合物中蛋白质的特征，但有一些方法可以研究它。如果有针对目标蛋白的抗体，可以进行超迁移实验，抗体与蛋白/探针复合物中的蛋白结合，延缓复合物的迁移，形成超迁移。在结合反应中加入增量抗体。抗体可以在与探针反应后加入到蛋白质中，或者提取物可以在加入探针前与抗体结合。根据抗体的特定抗原决定簇，前者有利于形成超迁移复合物，后者则阻止复合物的形成，导致原复合物强度降低。大部分实验都要滴定抗体，抗体与蛋白质的摩尔比为1: 1，然后增加抗体的量。当存在纯化的蛋白质时，它们可以与实验的条带迁移复合物进行比较。除了超迁移实验，还可以通过紫外交联和标记转移来分析复合物中蛋白质的特征。在均一标记探针和核提取物孵育后，复合物通过紫外线照射交联，然后未保护的探针通过DNase降解。需要均匀标记的探针，因为脱氧核糖核酸酶会从末端标记的探针上除去标记。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离由几个保护的核苷酸交联的蛋白质，干燥并放射自显影。结合蛋白的分子量可以与标准分子参照进行比较。蛋白质印迹分析也可以在具有靶蛋白抗体的复合物上进行(20)。如果蛋白质与DNA探针的特定序列结合，它可以通过含有保守结合序列和突变体的竞争性寡核苷酸来表征。定点突变也可用于改变保守序列的结合位点，以研究复合物的形成。
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