RT-PCR实验案例分析——中鼎生物
实验总结
通过TRIzol提取样品的总RNA，通过逆转录获得cDNA用于下游实验。
1.试剂和消耗品
试剂和消耗品
prime Script II 1st strand cDNA合成试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司，6210B；；总RNA提取试剂TRIzol，南京中鼎生物科技有限公司，rk 01-100；
DL2000 DNA加标记(100，250，500，750，1000，1500，2000 bp)，南京诺沃赞生物科技有限公司，MD101。GelStain，北京全食金生物科技有限公司，GS 101-01；
DEPC，适马公司，d 5758-25ml；；琼脂糖，Biowest，西班牙，91622；
离心管，美国Axygen，311-01-051；枪头，Axygen，美国；
其他试剂在中国都是分析纯。
2.主要实验仪器
主要实验仪器
超微紫外分光光度计:NanoDrop2000，Thermo公司；台式高速冷冻离心机，贝克曼公司，Allegra 21R；；
电子天平，AHOMS公司，ar 5120；；紫外线透射仪，Amersham Pharmacia公司，Hofer MV-25；
电泳仪:TY2795，BIO-RAD公司；电泳槽:亚细胞GT细胞，BIO-RAD公司；
凝胶成像分析系统:GelDocXR型号，BIO-RAD公司；雪花制冰机，日本三洋公司，SIM-f 140 ay 65；
移液器，德国Eppendorf。
3.实验方法和结果
3.1.RNA提取
(1)组织匀浆:向样品中加入1 ml TRIzol试剂(组织块的体积不应超过TRIzol体积的10%)，用移液管反复吹气。
(2)将匀浆在室温下放置5分钟，直到核酸和蛋白质完全解离。将0.2 ml氯仿加入到1 ml TRIzol试剂用量的均质浆液中，盖紧试管盖，手动剧烈摇动15 s，然后在室温下静置2 ~ 3 min。
(3)在4℃下10，000克，离心10分钟。
(4)小心吸取上层水相(无色)并加入新的试管中，同时计算吸取水相的体积。
(5)加入等体积的已预冷的异丙醇，盖紧管盖，轻轻摇动。
(6)在室温下静置65438±00分钟，直到RNA完全沉淀。
(7)在4℃下将10，000 g离心10分钟。
(8)弃去上清液(注意不要弃去沉淀)，向每个试管中加入1 ml的75%乙醇，盖紧试管，轻轻摇动离心管，除去残留的异丙醇和盐。在4℃下以7,500离心5分钟
(9)弃去上清液，打开管盖，沉淀并干燥RNA(在室温下挥发或真空干燥)。注意，RNA沉淀不能完全干燥，否则很难溶解。
(10)将RNA沉淀溶解在适量不含RNA酶的水中。
3.2.RNA琼脂糖凝胶电泳分析
提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图谱如下:
3.3.RNA浓度和纯度测试
3.4.RNA逆转录成cDNA
3.4.1.基因组DNA去除
使用来自中鼎公司的DNase I，在不含RNase的离心管中制备以下混合溶液:
3.4.2.逆转录反应
在PCR试管中准备以下反应混合物:
在65℃下反应5 min，然后在冰浴中冷却。
在第一步的反应管中制备如下逆转录反应溶液:
逆转录反应的条件为:30℃ 10分钟，42℃ 30分钟，95℃ 5分钟。冰浴冷却。该产品储存在-20℃的冰箱中。
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